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o presenza di Stenotrophomonas maltophilia, che può disintossicare l'ambiente idrolizzando gli antibiotici β-lattamici.Abbiamo scoperto che P. aeruginosa ha sviluppato rapidamente una resistenza all'imipenem tramite la perdita parallela di mutazioni funzionali nel gene della porina oprD.Sebbene il livello di resistenza non differisse tra i trattamenti in mono e co-coltura, la presenza di S. maltophilia ha aumentato il tasso di evoluzione della resistenza all'imipenem nella concentrazione di quattro μg/ml di imipenem.Inaspettatamente, l'evoluzione della resistenza all'imipenem ha coinciso con l'estinzione di S. maltophilia a causa dell'aumento della produzione di piocianina, che era citotossica per S. maltophilia.Insieme, i nostri risultati mostrano che l'evoluzione della resistenza ai patogeni può interrompere la protezione dell'esposizione agli antibiotici a causa dell'esclusione competitiva delle specie protettive.Tali feedback eco-evolutivi possono aiutare a spiegare i cambiamenti nell'abbondanza relativa di specie batteriche all'interno delle comunità CF nonostante la resistenza intrinseca ai farmaci anti-pseudomonali.L'evoluzione della resistenza agli antibiotici è una delle sfide più gravi che deve affrontare l'assistenza sanitaria moderna [1], causando oltre 1,2 milioni di decessi e decine di milioni di giorni in più di recupero all'anno [2, 3].Sebbene l'evoluzione della resistenza agli antibiotici sia stata ampiamente studiata in monocolture di laboratorio [4], abbiamo ancora una comprensione limitata di come si evolva la resistenza agli antibiotici in comunità multi-specie più complesse, in particolare durante le infezioni polimicrobiche [5, 6].Diversi studi hanno dimostrato che la presenza di specie microbiche non bersaglio può aumentare o diminuire l'efficacia dei trattamenti antibiotici [7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18].Ad esempio, la proteina-A stafilococcica prodotta da Staphylococcus aureus può interagire con il polisaccaride psl prodotto da Pseudomonas aeruginosa, alterando l'architettura del biofilm e aumentando la resistenza alla tobramicina di entrambe le specie patogene [9].Allo stesso modo, è stato dimostrato che la presenza di Stenotrophomonas maltophilia resistente agli antibiotici fornisce protezione dall'esposizione agli antibiotici a P. aeruginosa idrolizzando l'imipenem e disintossicando l'ambiente [10].Sebbene questi studi dimostrino che è probabile che le interazioni ecologiche alterino la forza dei trattamenti antibiotici, l'effetto delle interazioni tra le specie sulla velocità e sulla traiettoria dell'evoluzione della resistenza de novo non è ancora ben compreso [19,20,21,22,23, 24].La fibrosi cistica (FC) è una malattia genetica recessiva che provoca la disfunzione del canale ionico regolatore transmembrana della FC, portando a un'omeostasi ionica impropria e alla sovrapproduzione di muco denso che compromette la clearance mucociliare [25].Di conseguenza, le persone con FC mostrano un'immunità mucosale ridotta e sono altamente soggette a infezioni polmonari batteriche croniche [26].Mentre le comunità polmonari batteriche con fibrosi cistica sono spesso polimicrobiche, P. aeruginosa è il principale patogeno responsabile della polmonite batterica [27, 28], infettando cronicamente fino all'80% dei pazienti con fibrosi cistica [29,30,31,32].Altre specie batteriche comuni associate alla FC includono S. aureus, Burkholderia cepacia, Haemophilus influenzae e S. maltophilia [33,34,35].Di questi, S. maltophilia è un patogeno respiratorio emergente che infetta in modo persistente circa il 10-15% dei pazienti con FC [32, 36,37,38,39] ed è sempre più associato alla presenza di P. aeruginosa, in particolare nei pazienti più anziani [32, 36,37,38,39] 38, 40].Una ragione di ciò potrebbe essere che S. maltophilia possiede un ampio spettro di resistenza contro molti antibiotici comunemente usati per trattare P. aeruginosa, in particolare i carbapenemi [41, 42], che potrebbero consentire a S. maltophilia di persistere nel polmone quando altri patogeni specie sono state eradicate attraverso trattamenti antibiotici [5].L'elevata resistenza ai carbapenemi di S. maltophilia è principalmente causata dall'espressione di due β-lattamasi extracellulari codificate cromosomicamente, blaL1 e blaL2 [43,44,45,46], che idrolizzano gli antibiotici e disintossicano l'ambiente.Questo meccanismo di resistenza potrebbe anche promuovere la persistenza di specie batteriche polmonari sensibili e gli isolati clinici di S. maltophilia hanno dimostrato di proteggere P. aeruginosa dal carbapenem imipenem in condizioni di laboratorio [10, 47].In particolare, è stato dimostrato che l'idrolisi dell'imipenem mediata da β-lattamasi da parte di S. maltophilia fornisce protezione dall'esposizione agli antibiotici al ceppo sensibile di P. aeruginosa PA01 in co-colture, aumentando la concentrazione inibitoria minima (MIC) di P. aeruginosa fino a 16- piegare [10].Come previsto, questo effetto era più forte quando la densità relativa di S. maltophilia era maggiore e la concentrazione di antibiotici bassa.Sebbene non sia stata osservata alcuna evoluzione della resistenza de novo durante questi esperimenti a breve termine [10], non è chiaro come la protezione dell'esposizione possa alterare ed essere influenzata dall'evoluzione della resistenza agli antibiotici di P. aeruginosa su un arco di tempo più lungo.P. aeruginosa evolve rapidamente nel complesso ambiente polmonare CF nel corso dell'infezione cronica [48].Oltre ai trattamenti antibiotici, questi adattamenti sono guidati da molteplici fattori, tra cui l'ambiente polmonare, l'immunità dell'ospite e la presenza di specie batteriche concorrenti [48, 49].Il modo in cui questi fattori ecologici interagiscono nel determinare la traiettoria dell'evoluzione della resistenza agli antibiotici di P. aeruginosa rimane poco chiaro.Qui, ci siamo concentrati in particolare sullo studio dell'effetto della protezione dell'esposizione agli antibiotici da parte di S. maltophilia sull'evoluzione della resistenza della sensibile P. aeruginosa.La protezione dell'esposizione potrebbe modellare la traiettoria dell'evoluzione della resistenza agli antibiotici in diversi modi.In primo luogo, potrebbe potenzialmente indebolire la selezione per la resistenza riducendo la concentrazione selettiva di antibiotici nelle co-colture, migliorando la sopravvivenza di P. aeruginosa e rafforzando l'interazione ecologica tra le due specie.La riduzione del livello di antibiotici potrebbe alterare ulteriormente la selezione di specifiche mutazioni di resistenza, poiché è stato dimostrato che le concentrazioni sub-MIC cambiano la traiettoria dell'evoluzione della resistenza molecolare nella Salmonella enterica guidando l'accumulo sequenziale di mutazioni di resistenza epistatica a piccolo effetto [50] .In secondo luogo, è anche possibile che la protezione dell'esposizione da parte di S. maltophilia possa facilitare l'evoluzione della resistenza a P. aeruginosa supportando una crescita più rapida e aumentando il tasso di fornitura di mutazioni di resistenza [51].In terzo luogo, è probabile che l'evoluzione della resistenza da parte delle specie sensibili riduca l'importanza della protezione dell'esposizione, portando a potenziali feedback eco-evolutivi in ​​cui l'interazione ecologica iniziale guida e cambia come risultato dell'evoluzione della resistenza [20, 52].Per studiare queste domande, abbiamo condotto un esperimento di evoluzione in vitro di 24 giorni in cui abbiamo imitato la complessità nutrizionale e strutturale dell'espettorato polmonare CF utilizzando un mezzo di fibrosi cistica sintetica (SCFM) integrato con mucina suina [53].Questo sistema ha consentito la continua coesistenza di P. aeruginosa PA01 e ceppi clinici di S. maltophilia in assenza di antibiotici insieme a test sistematici dell'evoluzione della resistenza di P. aeruginosa a concentrazioni clinicamente rilevanti di β-lattame imipenem in assenza e presenza di S. maltophilia.I cambiamenti nella densità di popolazione di P. aeruginosa e l'evoluzione della resistenza agli antibiotici sono stati monitorati temporalmente durante l'esperimento e le mutazioni di resistenza sottostanti determinate dal sequenziamento.Abbiamo scoperto che la presenza di S. maltophilia ha portato a un tasso uguale e in un trattamento aumentato di evoluzione della resistenza all'imipenem attraverso la perdita parallela di mutazioni funzionali nel gene della porina oprD.Inaspettatamente, la P. aeruginosa resistente ha portato all'estinzione S. maltophilia a causa dell'aumento della produzione di piocianina in presenza di imipenem, che era citotossico per S. maltophilia.Insieme, questi risultati suggeriscono che l'effetto della protezione dall'esposizione agli antibiotici può essere interrotto dall'evoluzione della resistenza cromosomica nelle specie sensibili, portando a un feedback eco-evolutivo attraverso l'esclusione competitiva delle specie protettive.Per accertare se S. maltophilia può fornire protezione dall'esposizione agli antibiotici a P. aeruginosa, abbiamo prima misurato la capacità dell'isolato di S. maltophilia CF "518951" di degradare l'imipenem nel tempo utilizzando saggi surnatanti.SCFM è stato trattato con tre concentrazioni di imipenem e inoculato con PA01 o S. maltophilia, insieme a trattamenti "senza inoculo" e "senza antibiotici".Le colture sono state campionate ogni 8 h, sterilizzate con filtro e quindi reinoculate con PA01 sensibile a imipenem, che è stato coltivato per 24 h per valutare i cambiamenti nell'attività antimicrobica del mezzo.In uno studio precedente, abbiamo quantificato la degradazione chimica dell'imipenem da parte del ceppo di S. maltophilia "SM-518951" mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa [10].La presenza di S. maltophilia ha aumentato significativamente il tasso di disintossicazione dell'imipenem, consentendo la successiva crescita di P. aeruginosa nel filtrato (ANOVA: F1,43 = 79,60, p <0,001; Fig. 1A–D).Questo effetto è stato più pronunciato nei trattamenti con concentrazione di imipenem a 4 μg/ml e 8 μg/ml, dove la disintossicazione da S. maltophilia ha migliorato la crescita di PA01 rispettivamente dopo 24 h e 32 h, rispetto ai trattamenti di controllo non disintossicati (4 μg/ml Test t di Welch: MD = 9,32, SED = 0,72, t6,9 = 12,86, p < 0,001; 8 μg/ml: MD = 10,48, SED = 0,32, t5,6 = 33,27, p < 0,001).La presenza di S. maltophilia non ha avuto alcun effetto sulla crescita di PA01 in assenza di imipenem (test t di Welch: MD = 1,91, SED = 1,66, t9,3 = 1,15, p = 0,28), mentre è stata osservata una crescita migliorata dopo 16 h di disintossicazione nella concentrazione sub-MIC 1 μg/ml (MD = 5,21, SED = 1,34, t8,8 = 3,90, p = 0,0038).Come altri carbapenemi, imipenem è intrinsecamente instabile in soluzione acquosa [54, 55].Tuttavia, la rottura naturale dell'imipenem ha avuto solo un effetto marginale sulla sua attività antimicrobica a concentrazioni superiori alla MIC durante la scala temporale dell'esperimento.La capacità di S. maltophilia di degradare l'imipenem è stata misurata indirettamente in SCFM (AD; N = 6).SFCM con 0 µg/ml (A), 1 µg/ml (B), 4 µg/ml (C) e 8 µg/ml (D) imipenem è stato inoculato con P. aeruginosa PA01 ancestrale (blu), S. maltophilia (rosso) o nessun batterio (nero) e incubato per 48 h.Le colture sono state campionate a intervalli di 8 ore e sterilizzate con filtro prima dell'inoculazione con PA01:rfp, che è stato coltivato indipendentemente in tutti i filtrati per 24 ore e la crescita misurata a OD595 per quantificare indirettamente la degradazione dell'imipenem.E mostra le curve MIC per PA01:rfp in presenza (rosso) e assenza (blu) di S. maltophilia quando co-coltivato in SCFM (N = 12).PA01: la crescita specifica per rfp è stata misurata utilizzando l'intensità della fluorescenza rossa: eccitazione 532 nm, emissione 588 nm.Tutte le barre di errore corrispondono a ±un errore standard della media.L'effetto della protezione dell'esposizione a S. maltophilia sulla sensibilità all'imipenem PA01 è stato ulteriormente quantificato utilizzando saggi di concentrazione inibitoria minima (MIC), in cui è stata misurata l'abbondanza relativa di un isolato PA01 marcato in modo fluorescente "PA01: rfp" in presenza e assenza di S. maltophilia .La presenza di S. maltophilia ha aumentato significativamente la crescita di PA01 in presenza di imipenem (ANOVA: F1.380 = 10,79, p = 0,0011; Fig. 1E), aumentando la MIC media da 2 μg/ml a 8 μg/ml di imipenem.C'era anche un effetto di interazione significativo tra la presenza di S. maltophilia e la concentrazione di imipenem (ANOVA: F1.380 = 4,60, p = 0,033), dimostrando che l'intensità di questo effetto protettivo dipendeva dalla concentrazione di imipenem, che era più alta a 2 μg/ml concentrazione (Fig. 1E).Nel complesso, questi risultati mostrano che S. maltophilia è stata in grado di disintossicare SCFM, consentendo la crescita di P. aeruginosa PA01 in concentrazioni altrimenti inibitorie di imipenem.Per studiare le conseguenze che la protezione dell'esposizione ha sull'evoluzione della resistenza all'imipenem, abbiamo sviluppato il ceppo PA01:rfp da solo e in presenza di S. maltophilia in SCFM contenente 0, 1, 4 o 8 μg/ml di imipenem per 24 giorni.Abbiamo scoperto che rispetto alle monocolture, PA01 ha raggiunto densità cellulari significativamente più elevate in presenza di S. maltophilia durante i primi 8 giorni dell'esperimento in 4 μg/ml (ANOVA: F1,78 = 34,56, p <0,001; Fig. 2A) e 8 μg/ml di concentrazione di imipenem (F1,68 = 13,82, p <0,001; Fig. 2A).La presenza di S. maltophilia non ha avuto alcun effetto sulla densità cellulare di P. aeruginosa in co-colture a concentrazioni di imipenem di 0 μg/ml o 1 μg/ml (tutti p > 0,05).Inoltre, l'effetto della presenza di S. maltophilia sulla crescita di PA01 è diventato non significativo in tutte le concentrazioni di imipenem dopo 8 giorni dall'esperimento.La densità di P. aeruginosa nelle colture evolute (A) è stata misurata come intensità di fluorescenza rossa (RFI) prima che le popolazioni fossero trasferite in serie a SCFM fresco trattato con 0 µg/ml, 1 µg/ml, 4 µg/ml o 8 µg/ ml di imipenem ogni 2 giorni.Ciascun punto di campionamento rappresenta il punteggio medio su dieci popolazioni evolute in modo indipendente.L'evoluzione della resistenza all'imipenem PA01:rfp è stata misurata isolando una singola colonia di P. aeruginosa da ciascuna popolazione e confrontando la crescita in un intervallo di concentrazioni di imipenem utilizzando saggi di concentrazione inibitoria minima (MIC), prendendo l'area sotto la curva MIC (AUC MIC) come un proxy per la resistenza complessiva (B).Sono state eseguite due repliche tecniche per isolato e le barre di errore corrispondono a ± un errore standard della media.La resistenza all'imipenem degli isolati evoluti di P. aeruginosa da popolazioni indipendenti è stata confrontata utilizzando l'area sotto la curva MIC (MIC AUC) in 11 fasi di diluizione che vanno da 0,125 a 128 μg/ml di concentrazioni di imipenem (diluizioni al 50%).PA01 ha sviluppato resistenza all'imipenem sia a concentrazioni di imipenem di 4 μg/ml (MIC AUC ANOVA: F1,73 = 47,43, p <0,001) che di 8 μg/ml (F1,69 = 31,36, p <0,001), mentre non è stata osservata alcuna resistenza a 0 μg/ml (F1,73 = 3,53, p = 0,064) o 1 μg/ml di trattamenti con imipenem (F1,73 = 0,076, p = 0,78; Fig. 2B).L'evoluzione della resistenza all'imipenem è stata riflessa da un aumento medio dei breakpoint della MIC da 1,8 a 18,7 μg/ml nei cloni PA01 resistenti all'imipenem.Sebbene il livello complessivo di resistenza all'imipenem non differisse tra i trattamenti di concentrazione di 4 μg/ml e 8 μg/ml, la resistenza si è evoluta più rapidamente in presenza di S. maltophilia alla concentrazione di imipenem di 4 μg/ml (misurata da MIC AUC ANOVA: F1 ,73 = 11,30, p = 0,0012; Fig. 2B e punto di interruzione MIC ANOVA: F1,33 = 6,58, p = 0,015; SI Fig. 9).Al contrario, la presenza di S. maltophilia non ha avuto un impatto significativo sul tasso di resistenza alla concentrazione di imipenem di 8 μg/ml (ANOVA: F1,69 = 1,07, p = 0,30; Fig. 2B, Curve MIC individuali: SI Figg. 1–8).Nonostante sia costantemente esposto a concentrazioni di imipenem superiori alla MIC, P. aeruginosa si è estinta solo in una delle 60 popolazioni replicate trattate con imipenem (una replicata al 4° giorno a una concentrazione di 8 μg/ml di imipenem in assenza di S. maltophilia).Insieme, questi risultati mostrano che la presenza di S. maltophilia può aumentare il tasso di evoluzione della resistenza all'imipenem in P. aeruginosa, senza influenzare il livello complessivo di resistenza.Per studiare le mutazioni associate alla resistenza all'imipenem, abbiamo scelto casualmente un isolato di P. aeruginosa da sei popolazioni replicate evolute in modo indipendente da ciascun trattamento alla fine dell'esperimento di selezione (giorno 24).Gli isolati evoluti che erano stati co-coltivati ​​con S. maltophilia avevano una media di una mutazione (SD = 1,64) per isolato rispetto a 0,71 (DS = 0,62) mutazioni per isolato sequenziato da popolazioni di monocoltura (SI Tabella 1).Inoltre, gli isolati di P. aeruginosa che si erano evoluti in concentrazioni di imipenem di 0 e 1 μg/ml avevano in media 0,63 (DS = 1,71) mutazioni per isolato, rispetto a 1,08 (DS = 0,28) mutazioni per isolato evolute in 4 e 8 μg/ml concentrazioni di imipenem.La maggior parte delle mutazioni osservate non erano sinonimi (36/41) e di queste, 11 erano sostituzioni di amminoacidi, 10 inserimenti di codoni di stop, 13 frameshift, una delezione (3332 bp) e un inserimento (92 bp).È stato riscontrato che solo le mutazioni nel gene oprD si evolvono parallelamente tra le repliche di popolazioni evolute in modo indipendente.Abbiamo scoperto che tutti gli isolati sequenziati resistenti a imipenem da trattamenti con imipenem da 4 µg/ml e 8 µg/ml presentavano mutazioni non sinonimi nel gene oprD che codifica per la porina della membrana esterna OprD (24/24 di isolati sequenziati; SI Tabella 1), che è stato precedentemente collegato alla resistenza ai carbapenemi in P. aeruginosa [56].Mutazioni altamente parallele in questo locus rappresentano probabilmente l'evoluzione adattiva.Al contrario, nessuno degli isolati dalle concentrazioni di imipenem 0 µg/ml e 1 µg/ml presentava mutazioni oprD, indipendentemente dal fatto che si fossero evoluti in assenza o in presenza di S. maltophilia.Mutazioni parallele oprD sono state trovate ugualmente spesso in isolati coltivati ​​in assenza e presenza di S. maltophilia e consistevano in un'ampia varietà di inserzioni, delezioni e sostituzioni di singole basi attraverso una regione di 1119 bp all'interno del gene lungo 1332 bp (Fig. 3) .Otto isolati presentavano mutazioni oprD negli anelli strutturali (anse: 2, 5, 7 e 8), mentre i restanti 16 isolati presentavano mutazioni oprD nelle regioni non ad anello.Tutte le mutazioni oprD hanno comportato un cambiamento nel frame di lettura o l'introduzione di nuovi codoni di stop, ad eccezione di un isolato che possedeva una nuova giunzione strutturale lunga 91 bp (Fig. 3).Queste mutazioni quindi probabilmente hanno portato a una carenza nella funzione della porina della membrana esterna.Tutti gli isolati PA01:rfp resistenti a imipenem presentavano mutazioni con perdita di funzione nel gene oprD, che consiste di 1329 nucleotidi (nt) e codifica per un prodotto di 443 aminoacidi (AA).Il peptide OprD contiene un piccolo peptide segnale seguito da otto anelli transmembrana strutturali (L1-8).Ciascuna barra nera rappresenta una singola mutazione da un diverso isolato di P. aeruginosa evoluto in popolazioni separate (sei popolazioni replicate per trattamento, 24 popolazioni replicate in totale).Nessun isolato PA01 resistente a imipenem possedeva più di una mutazione nel gene oprD.Le informazioni sul tipo di mutazioni sono fornite sopra, indicando per le inserzioni "Ins(nt)", le eliminazioni "Del(nt)" e le sostituzioni di amminoacidi (AA) "posizione originale AA—AA—nuovo AA" (*= codone di stop) .La posizione del nucleotide nel gene oprD per ciascuna mutazione è mostrata tra parentesi.L'effetto previsto della mutazione sul gene è mostrato come frameshift (FS) o stop codon injection (SCI).Un isolato presentava un complesso riarrangiamento di una regione di 91 bp che ha portato alla formazione di una nuova giunzione strutturale (NJF).Per esplorare se l'evoluzione della resistenza all'imipenem ha imposto un costo di fitness per P. aeruginosa, abbiamo gareggiato direttamente con gli isolati PA01:rfp evoluti con il ceppo PA01 ancestrale non fluorescente, altrimenti isogenico, in SCFM in assenza di imipenem.Complessivamente, gli isolati evoluti hanno mostrato una maggiore fitness rispetto al ceppo ancestrale (Fig. 4A) dopo l'evoluzione in 0 µg/ml (test di Dunnett: MD = 0,38, p <0,001), 1 µg/ml (MD = 0,27, p <0,001 ) e 4 µg/ml di SCFM trattato con imipenem (MD = 0,16, p = 0,011), indicativo dell'adattamento del mezzo.Non è stata osservata alcuna differenza significativa nella forma fisica tra PA01 ancestrale e isolati evoluti originati dal trattamento con concentrazione di imipenem a 8 µg/ml (MD = 0,12, p = 0,059).I cambiamenti nell'idoneità degli isolati evoluti non sono stati significativamente influenzati dalla presenza o assenza di S. maltophilia durante l'esperimento di selezione (ANOVA: F1,75 = 0,050, p = 0,82).In tutti i trattamenti, abbiamo riscontrato una correlazione negativa tra la forma fisica degli isolati evoluti e la resistenza all'imipenem (regressione lineare multipla: F1,75 = 18,50, p < 0,001, R2 = 0,21), che non è stata influenzata dalla precedente esposizione a S. maltophilia ( F1,75 = 0,035, p = 0,85).Insieme, questi dati suggeriscono che la resistenza all'imipenem era costosa in termini di limitazione dell'adattamento di P. aeruginosa al mezzo di crescita.L'evoluzione della resistenza all'imipenem in P. aeruginosa si traduce in un compromesso con l'idoneità competitiva (A), che non è stata influenzata dall'assenza (blu) o dalla presenza (rosso) di S. maltophilia nelle culture evolute (basato sul coefficiente di correlazione della regressione lineare).Le regioni ombreggiate rappresentano intervalli di confidenza del 95% per le linee di regressione adattate.L'esposizione a imipenem induce l'esclusione competitiva di S. maltophilia resistente da P. aeruginosa in co-colture (B).Il grafico di sopravvivenza mostra la percentuale di popolazioni di co-coltura contenenti S. maltophilia (N = 10).Solo sei dei 48 isolati sequenziati presentavano mutazioni non sinonimi nei geni codificanti non OprD.Le mutazioni in questi geni non hanno mostrato alcun parallelismo e sono state osservate solo una volta in singoli isolati, il che suggerisce che erano improbabili legate alla resistenza all'imipenem.Quattro isolati del trattamento con imipenem da 0 µg/ml presentavano mutazioni nei geni: mvaT (S23P), PA0715 (C201Y e K227E), PA1874 (G964A, G964C e S1375T), PA2228:30 (3.332 bp del), pilA (S64G) e pilB (D388A).Un isolato del trattamento con imipenem da 1 µg/ml presentava una mutazione nel gene vfr (H164P) e due isolati evoluti nel trattamento con imipenem da 4 µg/ml presentavano mutazioni in PA4041(Y324D) e parS (T131P).Mentre la maggior parte degli isolati ha mostrato una migliore capacità competitiva rispetto al ceppo ancestrale, quattro hanno mostrato aumenti sorprendentemente elevati della forma fisica rispetto agli altri isolati evoluti, due dei quali sono stati inclusi nel nostro sequenziamento (ANOVA: F1,18 = 12,35, p = 0,0025; F1, 15 = 6,14, p = 0,026; Fig. 4A).Un isolato ad alto fitness aveva una singola mutazione nel gene vfr (H164P) mentre il secondo aveva quattro mutazioni non sinonimi, una nei geni pilA (S64G) e mvaT (S23P), insieme a due mutazioni nel gene PA0715 (C201Y e K227E) , indicando che queste mutazioni potrebbero aver contribuito agli aumenti di fitness osservati in SCFM.Per aiutare a capire cosa ha determinato i cambiamenti nella forma fisica competitiva, abbiamo confrontato la capacità degli isolati evoluti e dell'ancestrale PA01 di produrre la pioverdina, un sideroforo coinvolto nell'assorbimento e nel sequestro del ferro che svolge un ruolo importante nella competizione tra le risorse tra le specie [57, 58 ].La maggior parte degli isolati di PA01 evoluti ha mostrato un aumento della produzione di pioverdina rispetto al PA01 ancestrale (test di Dunnett: p <0,05 per tutti i confronti a coppie; SI Fig. 10), dimostrando che la sovraregolazione della pioverdina è probabilmente un adattamento chiave alla crescita in SCFM.Tuttavia, non abbiamo riscontrato una chiara differenza tra gli isolati evoluti in assenza o presenza di imipenem (ANOVA: F3,75 = 1,50, p = 0,22) o S. maltophilia durante l'esperimento di selezione (F1,75 = 0,19, p = 0,66; SI Fig. 10), suggerendo che la competizione per il ferro è improbabile spiega il compromesso tra resistenza agli antibiotici e fitness competitivo.In sintesi, questi risultati dimostrano che la resistenza all'imipenem si è evoluta attraverso la perdita di mutazioni funzionali nel gene oprD che sono emerse ugualmente spesso a concentrazioni di imipenem superiori alla MIC (sia in 4 che in 8 µg/ml) indipendentemente dalla presenza di S. maltophilia, e che il costo fitness della resistenza all'imipenem derivava dal ridotto adattamento al mezzo di crescita.La sopravvivenza di S. maltophilia è stata monitorata durante l'esperimento di selezione determinandone la presenza in co-colture mediante placcatura selettiva.Dopo 24 giorni di evoluzione sperimentale, S. maltophilia potrebbe essere rilevata nell'80% e nel 40% delle co-colture rispettivamente in trattamenti di concentrazione di imipenem a 0 μg/ml e 1 μg/ml.Al contrario, la sopravvivenza di S. maltophilia è diminuita nel tempo a concentrazioni di imipenem superiori alla MIC in presenza di P. aeruginosa (Fig. 4B; test Log-Rank: Z = 10,97, p = 0,012) ed è stata portata all'estinzione in 95 % (19 su 20) di repliche di co-culture.Fondamentalmente, la scomparsa di S. maltophilia nei trattamenti con imipenem 4 μg/ml e 8 μg/ml ha coinciso con l'evoluzione di una maggiore resistenza all'imipenem in P. aeruginosa durante i primi 12 giorni dell'esperimento di selezione (MIC ANOVA: F1,34 = 20,82 , p < 0,001, AUC ANOVA: F1,34 = 12,88, p = 0,0010, Figg. 2B, C, 4B).Contrariamente alle co-colture, non sono state osservate estinzioni di S. maltophilia in nessuno dei replicati di controllo della monocoltura indipendentemente dalla concentrazione di imipenem.Questi risultati suggeriscono che PA01 escludeva in modo competitivo S. maltophilia principalmente in concentrazioni di imipenem superiori alla MIC e che l'estinzione di S. maltophilia coincideva con l'evoluzione della resistenza all'imipenem di P. aeruginosa.Per comprendere meglio queste estinzioni, abbiamo testato se la presenza di imipenem aumentasse l'antagonismo di P. aeruginosa nei confronti di S. maltophilia.A tal fine, abbiamo coltivato isolati di P. aeruginosa resistenti all'imipenem in SCFM in assenza e presenza di 4 μg/ml o 8 μg/ml di imipenem, prima di individuarli su prati di agar SCFM di S. maltophilia per confrontare il livello di inibizione .P. aeruginosa resistente alla crescita in presenza di imipenem ha reso gli isolati significativamente più inibitori contro S. maltophilia (Modello misto effetto 24 ore: F1,61 = 9,98, p = 0,0025, d = 0,62; effetto 48 ore: F1,60 = 23,94, p < 0,001, d = 1,37; Fig. 5A), indipendentemente dal fatto che gli isolati resistenti si siano evoluti in concentrazioni di 4 μg/ml o 8 μg/ml di imipenem (Modello misto: F1,28 = 2,08, p = 0,16), oppure in presenza di S. maltophilia durante l'esperimento di selezione (F1,28 = 0,057, p = 0,81).La variazione tra gli isolati rappresentava solo il 7,6% della variazione totale del modello (test di Wald: p = 0,42).Inoltre, non è stata osservata alcuna differenza nell'attività inibitoria contro S. maltophilia tra gli isolati resistenti evoluti e l'ancestrale suscettibile PA01:rfp in assenza di imipenem (test di Dunnett: p > 0,05 per tutti i confronti a coppie), il che suggerisce che questo effetto è stato innescato principalmente dalla presenza di antibiotico, invece della precedente esposizione durante l'esperimento di selezione.Il trattamento con imipenem aumenta l'inibizione di S. maltophilia da parte di isolati resistenti di P. aeruginosa (A) indipendentemente dalla concentrazione di antibiotico evoluta o dalla presenza di S. maltophilia durante l'esperimento di selezione;I boxplot di Tukey rappresentano l'intervallo interquartile (25-75° percentile), i baffi mostrano i valori minimo e massimo e la linea mediana mostra il valore mediano (N = 8).Il trattamento con imipenem aumenta la produzione di piocianina negli isolati resistenti di P. aeruginosa (B).La piocianina è stata misurata utilizzando la densità ottica (695 nm) e normalizzata rispetto alla crescita batterica nelle colture precentrifugate (OD695/OD595) (N = 8).La piocianina limita la crescita di S. maltophilia nella coltura liquida (C), portando all'estinzione in concentrazioni pari e superiori a 0,13 µg/ml (D).In (D), le estinzioni sono state determinate come nessuna crescita osservabile di popolazioni replicate quando individuate su piastre di agar LB.Gli intervalli di confidenza rappresentano ± un errore standard dalla media (N = 4).Per esplorare il motivo per cui gli isolati resistenti di P. aeruginosa sono diventati più inibitori di S. maltophilia in presenza di imipenem, abbiamo testato se la presenza di imipenem ha influenzato la produzione di piocianina citotossica, che in precedenza ha dimostrato di essere sovraregolata durante l'esposizione agli antibiotici [59, 60 ] e di avere attività antimicrobica contro più specie batteriche [61, 62].Abbiamo osservato che la coltura di isolati di P. aeruginosa resistenti in presenza di imipenem ha aumentato significativamente la produzione di piocianina (modello misto: F1,63 = 21,65, p <0,001, d = 0,54; Fig. 5B), mentre non è stata osservata alcuna differenza rispetto a l'ancestrale PA01:rfp quando i ceppi sono stati coltivati ​​in assenza di imipenem (test di Dunnett: p > 0,05).Questi risultati non sono stati influenzati dagli isolati di P. aeruginosa che si erano evoluti in concentrazioni di imipenem di 4 μg/ml o 8 μg/ml (F1,29 = 1,40, p = 0,24) durante l'esperimento di selezione.Tuttavia, la precedente presenza di S. maltophilia ha portato a un aumento marginalmente inferiore della produzione di piocianina (F1,29 = 9,35, p = 0,0048), in particolare con i cloni che si erano evoluti nel trattamento con 4 μg/ml di imipenem.La variazione tra i ceppi era relativamente ampia, catturando il 35,1% della variazione totale del modello all'interno dei singoli trattamenti con imipenem (test di Wald: p = 0,023).Infine, abbiamo testato sperimentalmente l'effetto inibitorio della piocianina derivata da P. aeruginosa sulla crescita di S. maltophilia utilizzando saggi MIC.Abbiamo scoperto che la piocianina ha inibito significativamente la crescita di S. maltophilia (OD595 ANOVA: F1,42 = 127,05, p <0,001; Fig. 5C) con una MIC di 16,7 μg/ml, mentre un effetto minore è stato riscontrato con P. aeruginosa senza un punto MIC chiaro (F1,42 = 84,50, p < 0,001).In linea con questi risultati, l'esposizione alla piocianina non ha causato alcuna estinzione di P. aeruginosa a nessuna concentrazione, mentre nessuna popolazione di S. maltophilia ha potuto essere rianimata da colture trattate con concentrazioni di piocianina superiori a 0,52 μg/ml (Fig. 5D).Sulla base delle curve di calibrazione della piocianina sintetica, stimiamo che le concentrazioni medie di piocianina prodotta da P. aeruginosa resistente a imipenem erano: 3,3 μg/ml di piocianina (DS = 0,38) in 0 μg/ml di imipenem, 4,0 μg/ml di piocianina ( DS = 0,61) in 4 μg/ml di imipenem e 4,4 μg/ml di piocianina (DS = 0,28) in 8 μg/ml di trattamenti con imipenem.Insieme, questi risultati suggeriscono che l'evoluzione della resistenza agli antibiotici in P. aeruginosa ha coinciso con l'estinzione di S. maltophilia nelle co-colture, probabilmente a causa dell'aumento indotto dall'imipenem nella produzione di piocianina.Sta diventando sempre più evidente che il contesto ecologico dell'infezione polimicrobica può influenzare l'efficacia dei trattamenti antimicrobici [9, 10, 12, 14, 16, 17].Qui abbiamo testato come la protezione dell'esposizione agli antibiotici, conferita dall'idrolisi dell'imipenem da S. maltophilia concomitante, potrebbe modellare l'evoluzione della resistenza nel patogeno batterico inizialmente suscettibile di P. aeruginosa.È stato riscontrato che mentre la protezione dell'esposizione agli antibiotici aumentava il tasso di evoluzione della resistenza a P. aeruginosa a concentrazioni di 4 μg/ml di imipenem, non portava a differenze significative nel livello generale di resistenza evoluta, che erano causate da mutazioni parallele nella membrana esterna gene oprD codificante per la porina.Sorprendentemente, l'emergenza della resistenza all'imipenem è stata associata all'estinzione di S. maltophilia, mentre la coesistenza continua è stata osservata nella maggior parte delle co-colture di P. aeruginosa in assenza di imipenem.Ulteriori esperimenti hanno mostrato che l'esposizione all'imipenem ha innescato un aumento della produzione di piocianina da isolati resistenti di P. aeruginosa, che era altamente citotossico per S. maltophilia.Insieme, questi risultati dimostrano che l'evoluzione della resistenza può interrompere la protezione dell'esposizione agli antibiotici di derivazione ecologica, portando all'estinzione le specie inizialmente protettive a causa della maggiore concorrenza di interferenza.L'evoluzione della resistenza potrebbe quindi guidare i feedback eco-evolutivi nelle comunità di FC polimicrobiche, spiegando in parte il rapido ricambio delle specie e i cambiamenti nella composizione della comunità spesso osservati durante i trattamenti antibiotici in vivo.Medicinale.